Zanimajo nas številne teme, povezane z biologijo cianobakterij, od njihovega pojavljanja v naravnih habitatih, njihovih molekularnobioloških in biokemijskih lastnosti, da uporabe v biotehnologiji.
Še posebej nas zanimajo sistemi toksin-antitoksin in encimi, povezani s celično smrtjo. V preteklih nekaj letih smo pridobili dragocene izkušnje tudi na področju sintezne biologije cianobakterij.
Razumevanje okolja pomeni razumeti snovne lastnosti habitatov, poznati organizme, ki v njih živijo in odnose med njimi. Čeprav cianobakterije niso omejene le na vodna okolja, so najpogostejše seveda v vodnih ekosistemih. Ključna je njihova vloga v morjih, kjer večinoma kot plankton proizvajajo kisik, hkrati pa predstavljajo temelj prehranjevalne verige. Pomembne pa so tudi v sladkih vodah.
V sodelovanju s kolegi s Katedre za analizno kemijo lahko pridobimo zelo natančne podatke o kemijski sestavi okoljskih vod, v katerih živijo cianobakterije. Opravili smo vrsto simulacijskih poskusov, v katerih smo preverjali vpliv različnih snovi, ki jih redno najdemo v okolju, na rast cianobakterij. Celovito razumevanje teh dejavnikov je še vedno oddaljen cilj.
Nadalje želimo določiti prisotnost točno določenih cianobakterij v okolju. Vzorčenju običajno sledi preiskava koncentriranih vzorcev pod mikroskopom, vendar smo kmalu ugotovili, da za razlikovanje med enoceličnimi cianobakterijami nujno potrebujemo bolj natančna orodja. Zato smo se odločili razviti tehnike črtne kode DNA za razlikovanje med predstavniki istega rodu.
Pri razvoju črtne kode DNA smo izvedli poskus, v katerem smo pomnožili dele genoma 11 cianobakterijskih vrst oz. sevov. Dobljene produkte smo vstavili v plazmide, jih namnožili v bakterijah in določili nukleotidna zaporedja, ki smo jih primerjali s tistimi v bazah podatkov. Izkazalo se je, da je v bazah podatkov za cianobakterije iz rodu Synechocystis, ki so nas zanimale, zelo malo, raznolikost dobljenih zaporedij pa nenavadno velika, zato bo verjetno treba rod razdeliti na več novih rodov. Poleg tega smo ugotovili, da je mogoče že na osnovi dolžin produktov PCR ločevati med posameznimi podskupinami cianobakterij iz omenjenega rodu. Za razlikovanje med sevi zadošča določitev zaporedja regije ITS (notranjega prepisanega vmesnika). Zanimivo je, da smo našli številne polimorfizme posmeznih nukleotidov (SNP-je), ki kažejo na to, da kopije genov, ki zapisujejo za ribosomsko RNA, med seboj niso identične, ali da kopije genoma v celici med seboj niso identične.
Sprožilci iz okolja lahko povzročijo posedanje planktonskih cianobakterij in njihovo pritrjevanje na podlago. Poleg tega lahko cianobakterije ustvarijo biofilme, znotraj katerih so zaščitene pred okoljem. Neodgovorjena ostajajo vprašanja, kateri sprožilci so potrebni za razvoj biofilma in katere biokemijske spremembe se zgodijo, ko celice oblikujejo biofilm. S sicer omejenimi možnostmi za raziskave se poskušamo dokopati do vsaj nekaterih odgovorov.
Hitrost rasti cianobakterij ni odvisna samo od fizikalnokemijskih značilnosti okolja, v katerem rastejo, pač pa tudi od interakcij med organizmi. Preučevanje interakcij v kompleksnih okoljih je zahtevno, zato razvijamo eksperimentalne postopke za tovrstne raziskave.
V okviru projekta Po kreativni poti do znanja v letu 2018 izvajamo raziskave mikroorganizmov s področja Sečoveljskih solin. Pri delu sodelujeta podjetje Soline, d.o.o. in Morska biološka postaja Nacionalnega inštituta za biologijo. Cilj projekta je ugotoviti osnovne značilnosti solinskih blat, s katerimi spomladi premažejo dna solinskih bazenov, ter vpliv teh blat na petolo (mineralizirano mikrobno preprogo, ki sestavlja dno solinskih bazenov).
Iz evkariontskega sveta je znano, da pride do celične smrti po
natančno določenih mehanizmih, ki imajo nekatere značilnosti
reguliranega postopka ali programa. Celo nekroza, za katero so
nekoč menili, da poteka neregulirano, danes velja za programiran
celični proces (nekroptoza). Drugi primeri programirane celične
smrti so piroptoza, avtofagija in apoptoza. Apoptozo so natančno
preučevali že pred 10-20 leti pri številnih organizmih, za vse
pa je bilo značilno, da v procesu sodelujejo nekateri encimi, ki
razgrajujejo proteine. Te encime so poimenovali kaspaze. Pri
različnih organizmih so različni, tako da danes poznamo kaspaze
(npr. pri vretenčarjih) in kaspazam podobne encime, kakršne so
metakaspaze pri rastlinah. Pri bakterijah so ugotovili, da v
genomu obstajajo zapisi za sorodne proteine, ni pa bilo jasno,
ali so ti proteini encimsko aktivni ali ne. In tu se začenja
naša vloga...
Razumevanje mehanizmov celične smrti pri cianobakterijah je pomembno iz več razlogov. Možno bi bilo razviti nove pristope za izboljšanje biološke varnosti, saj bi npr. lahko prožili postopek celične smrti od znotraj. Zanimivo bi bilo tudi pospešiti celično smrt cianobakterij, kadar se te v okolju prekomerno razširijo v obliki algnega cveta.
Z uporabo bioinformatskih orodij smo ugotovili, da modelna cianobakterija Synechocystis sp. PCC 6803, ki smo jo uporabljali kot šasijo v sintezni biologiji, ima gen za kaspazni homolog, vendar protein, ki ga gen zapisuje, ne bi mogel biti aktiven zaradi mutacije v predpostavljenem aktivnem mestu. Zato smo se usmerili na sorodno in okoljsko pomembno cianobakterijo Microcystis aeruginosa, pri kateri v aktivnem mestu nismo opazili mutacije. Gen smo pomnožili in na njegovi osnovi pripravili rekombinantni protein. Odkrili smo, pri katerih laboratorijskih pogojih je protein mogoče pretvoriti iz neaktivne v aktivno obliko in raziskali encimske lastnosti tako dobljenega proteina. To je bil prvi dokaz, da so bakterijski kaspazni homologi res aktivne proteinaze. zaradi svoje relativno preproste strukture smo ta encim poimenovali 'ortokaspaza'. Rezultate te raziskave smo objavili leta 2015 v reviji Molecular Microbiology.
V nadaljevanju smo natančno pregledali genomski kontekst gena za ortokaspazo. Ugotovili smo, da je v bližini nenavadno veliko genov (a verjetno tudi nepopolnih genov) za pare toksin - antitoksin. Za to je možnih več razlag. Po eni bi lahko ortokaspaza in moduli toksin - antitokskin delovali vzajemno. To bi bilo zelo zanimivo, a najprej moramo preveriti, ali so ti moduli v resnici sploh aktivni. S toksini in antitoksini imamo že precej izkušenj, zato menimo, da bi v bližnji prihodnosti lahko odkrili kaj novega.
S cianobakterijskimi endotoksini smo se začeli podrobneje ukvarjati, ko smo iskali zanesljive efektorje za sinteznobiološke naprave za izboljšano biološko varnost. V znanstveni literaturi je bil takrat objavljen en sam članek o modulu toksin - antotoksin (TA) v cianobakteriji Synechocystis sp. PCC 6803, glede na podatkovo bazo TADB pa naj bi jih bilo v tej cianobakteriji kar 36.
Z bioinformatskimi orodji smo pregledali verjetne pare TA v
sevu PCC 6803 in izbrali dva, ki sta se zdela zanimiva za
podrobnejšo biokemijsko analizo. Kloniranje genov za ta dva para
je bilo zahtevno, saj se je očitno nekaj toksina kljub
odsotnosti induktorja izrazilo, toksin pa je bil aktiven.
Posredno je bil to dokaz, da smo res našli ustrezen in uporaben
par TA. Medtem se je v literaturi pojavil še en članek, v
katerem so opisali nov par TA is 'našega' seva, a na srečo je
šlo za par, s katerim se mi nismo ukvarjali.
Trenutno pripravljamo miligamske količine toksina in
antitoksina za analizo interakcije med njima. To delo poteka v
sodelovanju s skupino prof. Jurija Laha s Katedre za fizikalno
kemijo, ki je eno nadstropje nad nami.
Molekularni biotehnolog ima v svoji škatli z orodjem (večinoma
pa gre za genetske elemente, ki jih hrani v hladilniku in za
znanje, kako te elemente povezati in izrabiti) vektorje,
promotorje, ekspresijske kasete, ... podobno kot tudi sintezni
biologi. Skozi več let dela na področju sintezne biologije
cianobakterij smo si nabrali dragocene izkušnje, znanje pa
prenašamo tudi na študente, ki morajo dobro poznati tehnologijo
DNA tudi širše.
Naše izkušnje na področju vektorjev so bogate. Leta 2009
smo objavili članek o pripravi zmogljivega ekspresijskega
vektorja za proizvodnjo dvodomenskih proteinov, kot na primer
enoverižnih fragmentov protiteles (scFv), s katerimi smo delali
več let v sodelovanju z Zavodom za transfuzijsko medicino.
Nedavno pa smo začeli z delom na projektu, kjer sodelujemo s
skupino iz Rusije. Poskušamo namreč pripraviti boljši vektor za
izražanje v cianobakterijah od obstoječih, saj smo prav s tem
imeli v preteklosti nemalo težav - ne samo mi, pač pa številne
skupine, ki se ukvarjajo z izražanjem genov v cianobakterijah.
Za biotehnološko proizvodnjo v cianobakterijah v večjem merilu si je nemogoče predstavljati, da bi uporabljali drage induktorje. Zato smo se odločili natančneje raziskati promotorske sisteme za indukcijo na osnovi dodatka kovinskih ionov v gojišče. Najprej smo preverili vpliv različnih koncentracij kovinskih ionov (cikovih, selenovih, železovih, kobaltovih in bakrovih) na rast cianobakterij, saj so pogosto toksični za celice. Nato smo preverili, kako vplivajo na izražanje genov pod kontrolo promotorjev, ki se odzivajo na kovine.
Moč promotorjev je nasploh pomemben parameter pri izboru vektorja. V članku iz leta 2010, objavljenem v reviji Analytical Biochemistry, smo opisali alternativni pristop k določanju moči promotorja. Temelji na izražanju gena, ki bakterijam omogoča preživetje v prisotnosti antibiotika kanamicina.
Fluorometri, ki jih imamo na razpolago v laboratoriju, so se izkazali kot premalo občutljivi za zaznavanje pogosto zelo majhnih razlik v izražanju genov za fluorescirajoče proteine. Čeprav je uporaba fluorescenčnih reporterjev zelo razširjena, smo morali optimizirati kromogeni (Millerjev) test, ki temelji na aktivnosti encima betagalaktozidaze, ki je naš novi reporter v cianobakterijah. Pri tem zdaj dobivamo zanesljive in ponovljive rezultate.
Naš prvi (objavljiv) rezultat s področja sintezne biologije je bil razvoj zmogljivega ekspresijskega vektorja za proizvodnjo dvodomenskih proteinov. Delo smo začeli s standardnim sinteznobiološkim klonirnim vektorjem pSB1AC3, nato pa smo v več korakih sestavili vektor, ki smo ga kasneje uspešno uporabili za pripravo enoverižnih fragmentov protiteles proti prionskemu proteinu. Podrobnosti si lahko preberete v članku iz leta 2009, objavljenem v reviji Protein Expression and Purification.
V naslednji stopnji smo razvili sistem za merjenje moči promotorjev. Za razliko od velike večine takih naprav, ki temeljijo na meritvah fluorescence, smo pripravili vektorsko napravo pri kateri je reporter pravzaprav protein, ki zagotavlja odpornost bakterije proti antibiotiku. Tako je torej gostota celične kulture proporcionalnoa moči promotorja. Vektor je zelo majhen in omogoča enostavno zamenjavo promotorskih zaporedij. Poleg tega smo razvili spletno orodje za obdelavo podatkov - izmerjenih gostot celičnih kultur. Podrobnosti najdete v članku, ki je izšel leta 2010 v reviji Analytical Biochemistry.
Biološka varnost je bila v ospredju naših sinteznobioloških poskusov v obdobju 2012-15. Razvijali smo sisteme za induciranje celične smrti, takoimenovana ubijalska stikala (angl. kill switch), ki bi jih bilo mogoče vklopiti v primeru, ko bi cianobakterije ušle iz kontrolirange okolja, v katerem jih gojimo. Uporabili smo dva osnova pristopa: z moduli toksin - antitoksin in z moduli nukleaza - inhibitor nukleaze. Delo smo uspešno zaključili in objavili v reviji Biology Open aprila 2016. Več o tem je tudi v odstavku o biološki varnosti v nadaljevanju.
Po tem, ko smo sodelovali kot mentorji slovenskih študentskih ekip za tekmovanja iGEM že leta 2006 in 2007, smo skupaj s Kemijskim inštitutom (KI) sestavili in vodili tudi prvo slovensko dijaško ekipo za to tekmovanje. Leta 2015 so tako dijaki sinteznobiološki del poskusov opravili v naših laboratorijih, biotehnološki pa na KI. Dijaki so bili zelo uspešni, saj so se v svoji starostni skupini uvrstili med 5 najboljših na petih različnih področjih, tudi v skupni uvrstitvi. Za opravljene naloge so dobili tudi zlato medaljo.
Predvsem pri proizvodnji v velikem merilu, kjer gojimo gensko spremenjene cianobakterije, je vprašanje biološke varnosti takih naprav zelo pereče. V okolju, kamor je postavljen proizvodnji obrat, nedovomno živijo cianobakterije, kar še posebej velja za obrate, ki temeljijo na odprtih bazenih. Ko govorimo o proizvodnji na veliko, pa se zdi, da je to trenutno edini tip gojenja, ki je ekonomsko upravičen.
Za povečano biološko varnost smo razvili dva pristopa, ki temeljita na uporabi sinteznobioloških orodij. Pri prvem pristopu smo preuredili obstoječe module toksin-antitoksin, ki jih ima sicer cianobakterija divjega tipa, s spremembo regulatornih regij pa smo uvedli neravnovesje na tak način, da bi toksin preprečil nadaljnjo rast gensko spremenjenih cianobakterij, ne pa naravnih.
Pri dugem pristopu smo ubijalsko stikalo izvedli z nukleazo, ki je v ravnotežju z inhibitorjem nukleaze, dokler so celice v kontroliranih pogojih. Zunaj fotobioreaktorja pa bi lahko sprožili zvišanje koncentracije nukleaze, ki bi posledično razgradila lastne nukleinske kisline. Celica bi postopno odmrla, razgrajena DNA pa ne bi mogla povzročiti morebitne rekombinacije v celicah divjega tipa.
Veliko truda je bilo potrebnega in delati je bilo treba izredno natančno, da smo našli tako kombinacijo regulatornih elementov, da je sistem deloval. Članek smo objavili v reviji Biology Open aprila 2016.
Kljub ogromnemu potencialu, ki ga imajo gensko spremenjene alge, je še vedno smiselno investirati v konvencionalno biotehnolgijo na osnovi alg. Alge so vir številnih zanimivih molekul, ki jih proizvajajo poceni in v zadostnih količinah, zato večina raziskovalcev s tega področja meni, da čas algne biotehnologje šele prihaja. Na fakulteti imamo znanje in opremo za odkrivanje zanimivih molekul iz naravnih vzorcev (angl. bioprospecting), izolacijo v malem merilu in za opis biokemijskih lastnosti učinkovin. Leta 2015 smo se pridružili evropski inciativi COST "Evropska mreža za algne bioprodukte" preko katere smo pridobili dodaten vpogled v klasično algno biotehnologijo, od gojenja celic za pridobivanje biomase, do žetve in končnih produktov. Na fakulteti imamo tudi dostop do 70-litrskega fotobioreaktorja, ki je primeren za pilotno rast nepritrjenih (mikro)alg in zanj načrtujemo, da bi ga v bodoče tudi uporabljali.
2018
KLEMENČIČ, Marina, FUNK, Christiane. Type
III metacaspases: calcium-dependent activity proposes new
function for the p10 domain. New Phytologist 218(3),
1179-1191.
KLEMENČIČ, Marina, FUNK, Christiane. Structural
and functional diversity of caspase homologues in non-metazoan
organisms. Protoplasma 255(1), 387-397.
2017
JUTERŠEK, Mojca, KLEMENČIČ, Marina, DOLINAR, Marko. Discrimination between Synechocystis members (cyanobacteria) based on heterogeneity of their 16S rRNA and ITS regions. Acta Chimica Slovenica 64(4), 804-817.
KLEMENČIČ, Marina, NIELSEN, A.Z., SAKURAGI, Y., FRIGAARD, N.-U., ČELEŠNIK, Helena Sabina, JENSEN, P.E., DOLINAR, Marko. Synthetic biology of cyanobacteria for production of biofuels and high-value products. In: GONZALEZ-FERNANDEZ, Cristina & MUÑOZ, Raul (Eds.). Microalgae-based biofuels and bioproducts : from feedstock cultivation to end-products, (Woodhead Publishing Series in Energy). Kidlington: Woodhead Publishing. pp. 305-325.
2016
KLEMENČIČ, Marina, DOLINAR, Marko (2016) Orthocaspase
and toxin-antitoxin loci rubbing shoulders in the genome of
Microcystis aeruginosa PCC 7806. Current Genetics 62(4),
669-675.
ČELEŠNIK, Helena, TANŠEK. Anja, TAHIROVIĆ, Aneja, VIŽINTIN,
Angelika, MUSTAR, Jernej, VIDMAR, Vita, DOLINAR, Marko (2016) Biosafety of
biotechnologically important microalgae: intrinsic suicide
switch implementation in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC
6803. Biology Open 5, 519-528.
KLEMENČIČ, Marina, OSOJNIK ČRNIVEC, Ilja Gasan, PINTAR, Albin, DOLINAR, Marko (2016) Sintezna biologija za proizvodnjo biobutanola. Acta Chimica Slovenica 63(1) S3-S9.
2015
KLEMENČIČ, Marina, NOVINEC, Marko, DOLINAR, Marko (2015)
Orthocaspases are proteolytically active prokaryotic caspase
homologues: the case of Microcystis aeruginosa. Molecular
microbiology 98(1), 142-150.
2014
ŠKRLJ, Nives, DOLINAR, Marko (2014) New
engineered antibodies against prions. Bioengineered 5(1),
1-5.
2013
ŠKRLJ, Nives, DREVENŠEK, Gorazd, HUDOKLIN, Samo, ROMIH, Rok,
ČURIN-ŠERBEC, Vladka, DOLINAR, Marko (2013) Recombinant
single-chain antibody with the trojan peptide penetratin
positioned in the linker region enables cargo transfer across
the blood-brain barrier. Applied biochemistry and
biotechnology 169(1), 159-169
2011
ŠKRLJ, Nives, VRANAC, Tanja, POPOVIĆ, Mara, ČURIN-ŠERBEC,
Vladka, DOLINAR, Marko (2011) Specific
binding of the pathogenic prion isoform: development and
characterization of a humanized single-chain variable antibody
fragment. PLoS one 6(1), e15783
2010
ŠKRLJ, Nives, VIDRIH, Zlatko, DOLINAR, Marko (2010) A
universal approach for promoter strength evaluation supported
by the web-based tool PromCal. Analytical biochemistry
396(1), 83-90
ŠKRLJ, Nives, ČURIN-ŠERBEC, Vladka, DOLINAR, Marko (2010) Single-chain
Fv antibody fragments retain binding properties of the
monoclonal antibody raised against peptide P1 of the human
prion protein. Applied biochemistry and biotechnology
160(6), 1808-1821.
2009
ŠKRLJ, Nives, ERČULJ, Nina, DOLINAR, Marko (2009) A
versatile bacterial expression vector based on the synthetic
biology plasmid pSB1. Protein expression and purification
64 (2), 198-204.